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      普林斯頓 BAC DNA分離試劑盒
      折 扣 率: 0
      最后更新:2017-06-26
      關(guān) 注 度:2797
      生產(chǎn)企業(yè):深圳市國泰宜豐科技有限公司
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      產(chǎn)品詳細(xì)介紹 PSI Clone BAC DNA 分離試劑盒 


      PSI Clone BAC DNA試劑盒能夠便利地分離出高質(zhì)量的BAC DNA。所獲的DNA足夠用于至少一次測序反應(yīng)以及其它生化定性分析(例如限制性酶切)。一般從過夜培養(yǎng)的3-5mL培養(yǎng)物中可以獲得0.6-1.0μg DNA。
      細(xì)菌人工染色體作為載體,含有從F因子附加體中獲得的復(fù)制起點(diǎn)。這使得大的DNA片斷(>150kb)的穩(wěn)定克隆成為可能。F因子的復(fù)制起點(diǎn)是一種嚴(yán)緊型的復(fù)制子,它只允許單個(gè)細(xì)胞中的每個(gè)BAC分子產(chǎn)生1-2個(gè)拷貝。BAC克隆的低拷貝數(shù)使其潛在的產(chǎn)量限制在100-200ng/ml,F(xiàn)在的流程需要大體積的培養(yǎng)物(50-200mL)以獲得足夠純的mg級(jí)的BAC DNA用于分子操作。這些分離BAC DNA的大體積的流程一般包括酶解步驟或有機(jī)抽提,而且許多是各個(gè)實(shí)驗(yàn)室所獨(dú)有的的方法。PSI Clone BAC DNA試劑盒利用了簡單的離心柱的流程,不需有機(jī)抽提就能獲得高純度的BAC DNA。


      試劑盒組分
         
      重懸緩沖液(1)    13 ml RNA 酶A 1 Vial
      裂解液(2)            13 ml BAC DNA柱 25 ea
      中和緩沖液(3 )       13 ml Tube管架 4 ea
      平衡緩沖液(4)    15 ml PSI 壓力槍頭 1 ea
      清洗緩沖液(5)        50 ml 說明卡 1 ea
      洗脫緩沖液(6)    10 ml 包括在了BAC柱包裝中



      PSI Clone BAC DNA試劑盒使用方法(適用于3-5mL培養(yǎng)物)產(chǎn)品號(hào) PP-120。

      推薦使用含有20 μg/mL氯霉素的 Terrific Broth培養(yǎng)基時(shí),生長培養(yǎng)20-24小時(shí),OD600可達(dá)4-6。
      1. 加0.5mL重懸緩沖液于RNase A管,溫和混勻,
      2. 將過夜培養(yǎng)的3-5mL培養(yǎng)物離心,倒掉培養(yǎng)基。
      3. 輕輕地吹打細(xì)胞沉淀使其重新懸浮于0.5mL含有RNAse A重懸緩沖液中,再轉(zhuǎn)到一個(gè)干凈的1.5mL的EP管中。

      4. 加入0.5mL裂解緩沖液(2),輕輕地上下倒轉(zhuǎn)混合(注:裂解物可以不清亮),室溫放置10分鐘。
      5. 加入0.5mL中和緩沖液(3),輕輕地上下倒轉(zhuǎn)混合直到濃濃的白色沉淀物形成,冰浴10分鐘。
      6. (20,000 x g)離心10分鐘,將上清液收集并轉(zhuǎn)到一個(gè)無菌試管中(如15 mL Falcon試管或類似的試管)。
      7. 用1.0mL無菌水稀釋已澄清裂解物,吹打均勻。
      8. 將0.5mL的平衡緩沖液(4)加入到BAC離心柱上,震蕩,控干離心柱。
      9. 將稀釋好的裂解物加到離心柱上,控干離心柱?梢杂肞SI Pressure槍頭啟動(dòng)裂解物的流動(dòng)。
      10. 用1.0mL清洗緩沖液(5)清洗BAC離心柱2次,控干,750 x g離心2分鐘,干燥離心柱。
      11. 將50-100μL的洗提緩沖液加入到樹脂的頂端,室溫孵育2分鐘,750x g離心2分鐘,收集洗提液。

      12. 加1倍體積的異丙醇并混勻,以沉淀BAC DNA。20,000 x g離心30分鐘,沉淀DNA。棄去上清,用200μL 70%乙醇清洗沉淀。20,000 x g離心5分鐘,棄去乙醇,風(fēng)干。

      13. 將沉淀重懸于20μLTE或其它低鹽緩沖液中。

      未提供但必須的材料: 
            微型離心機(jī)
            無菌試管和1.5mL小離心管
            冰浴
            2-丙醇
            70%乙醇


      推薦的測序條件:
      利用ABI PRISM BigDye Terminator 循環(huán)測序預(yù)備反應(yīng)可以完成測序過程。

      試劑盒如下
         Template        200-400 ng in 11.0 μL
         Primer M131        3.2 pmol in 1.0 μL
         Reaction Mix 8.0 μL
        Total                 20
       
      PCR conditions (Perkin Elmer 9600):
         Step 1. 98C for 5 min
         Step 2. 98C for 30 sec
         Step 3. 55C2for 20 sec
         Step 4. 60C for 4 min
         Step 5.  Cycle to Step 2 30x
         Step 6. 60C for 5 min
         Step 7. 4C for Variable Time
       
      1M13 前面的引物序列 GTA AAA CGA CGG CCA GT (Tm = 53) 出現(xiàn)在pBeloBAC11中。
      2退火溫度可以根據(jù)引物不同而有所改變。
      測序產(chǎn)品是用CENTRI SEP(Princeton Separations, Catalog # CS-901)純化的,并且在Savant Speed-Vac中干燥。
      把所有的測序反應(yīng)物都加到膠上以獲得充足的信號(hào)是很重要的。將反應(yīng)物重懸在最小體積中(如1μL),并且要把孔中所有的反應(yīng)物都加上樣。
       
      一些有幫助的信息:
      裂解不完全或者培養(yǎng)密度太高會(huì)導(dǎo)致染色體DNA過多。稀釋培養(yǎng)物使得OD600為6.0,每次取樣時(shí)取5mL稀釋的培養(yǎng)物。
      裂解的過程中不要震蕩樣品,輕輕地顛倒樣品幾下就足夠了。
      不要縮短孵育時(shí)間否則染色體DNA將不會(huì)沉淀。
      如果離心時(shí)的離心力達(dá)不到20,000 x g,則需要延長離心時(shí)間使得離心力與時(shí)間的乘積大致相等。
      第7步中用無菌的試劑級(jí)的水稀釋澄清的裂解產(chǎn)物,這樣不會(huì)堵住柱子基質(zhì)。稀釋的裂解產(chǎn)物流出很慢可能是因?yàn)榛|(zhì)或玻璃材料中有氣泡阻塞。PSI Pressure Tip(壓力槍頭)可以幫助裂解產(chǎn)物流出來。把Pressure Tip裝在一個(gè)3mL的注射器上,把槍頭直接插入柱子中擠壓活塞使裂解產(chǎn)物以每秒1滴的速度往下流。
      第10步務(wù)必根據(jù)說明離心出剩余的清洗緩沖液。11步中在回收洗脫液之前使洗脫緩沖液在基質(zhì)中孵育至少2min。
      DNA的丟失經(jīng)常出現(xiàn)在沉淀這一步。沉淀幾乎看不到主要是因?yàn)镈NA的含量很少(大約1mg)。離心的時(shí)候離心管的方向最好是一致的,這樣就會(huì)知道沉淀在什么地方。吸出上清的時(shí)候要注意不要把沉淀帶走。
      如果以前產(chǎn)量很高的克隆出現(xiàn)產(chǎn)量很少的問題(每個(gè)樣品<50ng),通常是由于重組導(dǎo)致了插入片段的丟失。此時(shí)可用限制性酶切和電泳來確定一下插入片段的大小。由于BAC的插入片段有固定的拷貝數(shù),所以重組會(huì)導(dǎo)致插入片段變小及產(chǎn)量的減少。
      從某些E.coli菌株(如HB101及其衍生系)中分離出的DNA不太適合測序用。我們建議使用DH10B宿主菌株。

      PSI Clone BAC DNA 試劑盒產(chǎn)品號(hào) PP-120
      使用重力/離心柱流程,伴隨堿性裂解法,該試劑盒可以從3-5mL培養(yǎng)物(OD600Η4-6)中分離0.6-1μg BAC DNA,且僅用200 ng做模板即可得到極好的測序結(jié)果。由此表明該試劑盒的高純度性。每包裝使用25次。

      訂貨信息:
        
      貨號(hào)                 規(guī)格
      PP-120     BAC DNA Kit - 25 preps
       
       
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